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高通量|這才是藻類研究真正需要的一款工具!

更新時(shí)間:2022-07-26  點(diǎn)擊次數(shù):1451

ROTOR+最初是為芽殖酵母(釀酒酵母)遺傳學(xué)而設(shè)計(jì)。對(duì)萊茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)進(jìn)行大規(guī)模的遺傳篩選,ROTOR+的功能可以發(fā)揮很大的作用。然而,衣藻與出芽酵母菌在細(xì)胞大小、生長(zhǎng)速度、菌落形態(tài)和粘附性以及光響應(yīng)性方面存在差異。因此,ROTOR+能否適用于衣藻類研究成為了關(guān)鍵。

因此在測(cè)試過程中要解決的下面的問題顯得尤為重要:

Q1:細(xì)胞是否通過ROTOR+可靠地從液體或固體介質(zhì)中挑取到RePads復(fù)制針板上,在針頭之間、針板之間、不同平板間,細(xì)胞的數(shù)量/密度是否可以再生?

A1:可重復(fù)性挑取和接種的細(xì)胞數(shù)量,取決于細(xì)胞的表面特性:有多粘稠,粘附(或被排斥)在瓊脂表面的程度等等。衣藻在這些特性上不同于酵母。例如,在使用絲絨(酵母的標(biāo)準(zhǔn)方法)進(jìn)行復(fù)制時(shí),衣藻菌落有很強(qiáng)的傾向,要么*粘在平板上,要么*轉(zhuǎn)移到絲絨上。

Q2:細(xì)胞在此過程中是否保持高活力?

A2:轉(zhuǎn)移的細(xì)胞保持高活力顯然是必要的。從我們最初的工作中可以清楚地看出,在許多方面,衣藻在某些操作過程中比酵母菌或大腸桿菌更容易受到損傷。例如,當(dāng)從瓊脂上挑取到玻璃或不銹鋼針上時(shí),衣藻在空氣中大約40秒后就會(huì)幾乎*喪失生存能力。

Q3:針頭之間、源板之間或靶板之間是否有明顯的交叉污染?

A3:根據(jù)生物體的特性,可以很容易地想象,活細(xì)胞氣溶膠可以通過ROTOR+復(fù)制操作傳播,導(dǎo)致交叉污染和破壞實(shí)驗(yàn)。

Q4:使用ROTOR+可以可靠接種和區(qū)分的菌落最大密度是多少?

A4:菌落可以被接種的最大密度取決于生物體的大小和生長(zhǎng)速度,并將影響對(duì)生物體進(jìn)行篩選的通量。

首先通過ROTOR+對(duì)液體到瓊脂的轉(zhuǎn)移展開相關(guān)實(shí)驗(yàn)。

用Singer PlusPlates方板,注入50ml的TAP瓊脂(標(biāo)準(zhǔn)衣藻培養(yǎng)基),并添加了50μg/ml氨芐西林來(lái)抑制細(xì)菌污染。由于衣藻在液體介質(zhì)中具有很強(qiáng)的流動(dòng)性,對(duì)光線也有很強(qiáng)的敏感性,因此需要將ROTOR+上的內(nèi)部光源取下,并在操作過程中盡可能遮擋光線。如果沒有這種預(yù)防措施,藻類會(huì)在源板的不同區(qū)域強(qiáng)烈聚集,會(huì)嚴(yán)重影響整個(gè)板的菌落再現(xiàn)性。

用一個(gè)注入25ml TAP的液體培養(yǎng)基平板,其中含有約10^6cells/ml濕的衣藻(cc-124背景),用384RePad長(zhǎng)針,從液體到瓊脂,從384密度排列成1536密度,(針重復(fù)利用)。在33°C強(qiáng)光照下培養(yǎng)3天(圖1A),每隔一段時(shí)間顯微鏡觀察。

圖1:液體到瓊脂轉(zhuǎn)移

可以看到菌落具有明顯的活力,基本上每個(gè)細(xì)胞被接種18小時(shí)都形成了一個(gè)微菌落(圖1C)。平板的圖像顯示了接種區(qū)域的再生性,不同平板之間也觀察到良好的再生性。

另一方面,在這種固定密度下,菌落之間有明顯的空間分隔,中間沒有污染的菌落產(chǎn)生。

ROTOR+從挑取到接種需要5-10秒。為了測(cè)定在空氣中RePad上的衣藻活力,在挑取衣藻后和接種前分別暫停0、10、20和40秒,轉(zhuǎn)移的細(xì)胞數(shù)量及培養(yǎng)后的活力基本保持不變。從含有50ml細(xì)胞懸浮液的SINGER平板中,測(cè)試了液體到瓊脂的轉(zhuǎn)移,結(jié)果基本相同,表明了有效液滴大小與針插入的液體深度幾乎無(wú)關(guān)。

接下來(lái)通過ROTOR+從瓊脂到瓊脂的轉(zhuǎn)移展開實(shí)驗(yàn)。

以含有TAP瓊脂的Singer PlusPlate方板為來(lái)源板,上有cc-124背景的衣藻菌膜。使用384RePad長(zhǎng)針挑取細(xì)胞并轉(zhuǎn)移到新板上,連續(xù)點(diǎn)種16個(gè)點(diǎn),過程中不回到來(lái)源板,這形成6144個(gè)點(diǎn),每16個(gè)點(diǎn)逐漸稀釋接種物。用顯微鏡檢查這些培養(yǎng)皿,并培養(yǎng)成菌落。

從培養(yǎng)的菌落來(lái)看,菌落直徑約1毫米,連續(xù)接種導(dǎo)致轉(zhuǎn)移細(xì)胞的數(shù)量逐漸減少,該方法可用于將接種密度降低到孤立的單細(xì)胞。瓊脂-瓊脂接種的細(xì)胞存活率通常很高,幾乎相當(dāng)于液體-瓊脂接種。

一般來(lái)說,單個(gè)細(xì)胞和由此產(chǎn)生的菌落和微菌落都停留在由針的幾何形狀決定的空間邊界內(nèi),因?yàn)橐略逶谄桨迳鲜遣换顒?dòng)的,而且?guī)缀醪恍枰獓婌F或氣溶膠就可以精確地進(jìn)行操作。因此,這些程序適用于在有限的空間和耗材里,最大限度培養(yǎng)和轉(zhuǎn)移衣藻。

 

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